水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA

水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA | 时间: January-5 20:43:31 | 分类:技术栏目

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实验原理
 闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒DNA由于构形不同,在加溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率,因而在紫外灯下观察,能区别闭合环状质粒DNA(cccDNA)、线性质粒DNA(L-DNA)和开环质粒DNA(ocDNA)。
实验材料和试剂
 (一)实验样品
 质粒pUC118
 (二)试剂
 1.l DNA/HindIII分子量标准
 2.溴酚蓝指示剂点样缓冲液
    0.2%     溴酚蓝
    50%       蔗糖
 3.1mg/ml溴化乙锭溶液
 4.电泳缓冲液(TAE)
    40 mmol/L   Tris-乙酸
    1 mol/L     EDTA
 (配制方法:24.2克Tris碱,5.71ml冰乙酸,10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0),定容至5000ml)
5.0.7% 琼脂糖凝胶
(配制方法:称取琼脂糖0.35克,加入50ml TAE电泳缓冲液)
 (三)仪器
 微量移液器           电泳仪
 水平电泳槽           透射紫外观察仪
实验步骤
 1.选择合适的水平式电泳槽,调节电泳槽平面至水平。检查稳压电源与正负极的线路。
 2.选择孔径大小合适的点样梳子,垂直架在电泳胶模的一端,使点样梳子底部离电泳胶模底部的距离为1.0mm。
 3.制备0.7%琼脂糖凝胶,100℃水浴加热至琼脂糖融化均匀。
 4.用吸管取少量琼脂糖凝胶溶液将电泳胶模四周密封好,防止浇灌琼脂糖凝胶板时发生渗透。待琼脂糖凝胶冷却至60℃左右时,加入一滴溴化乙锭,摇匀,轻轻倒入电泳胶模中,琼脂糖凝胶的厚度在3~5mm。倒胶时要避免产生气泡,若有气泡可用吸管小心吸去。
 5.琼脂糖凝胶凝固后,在室温放置20分钟,小心拔掉点样梳子和电泳胶模两端的挡板,保持点样孔的完好。
 6.将电泳胶模放入电泳槽中,加入电泳缓冲液,使电泳缓冲液面高出琼脂糖凝胶表面1~2mm。如点样孔内有气泡,用吸管小心吸出,以免影响加样。
 7.将15ml DNA样品与1/5体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液混合。上样缓冲液不仅可以提高样品的密度,使样品均匀沉到样品孔内,还可以使样品带颜色,便于上样和估计电泳时间和判断电泳的位置。
 8.用微量移液器将样品小心加入加样孔内,记录样品点样秩序。
 9.盖上电泳槽,开启电源开关,最高电压不超过5V/cm(100~150V恒压电泳),使DNA从负极向正极移动。
 10.电泳时间随实验的具体要求而异。电泳一般需1~3小时。电泳完毕后关闭电源,戴一次性塑料手套取出凝胶,尽可能将所有的电泳缓冲液淋干,在254nm波长的透射紫外灯下观察。
 
【提示】
 (一)琼脂糖凝胶电泳
 1.琼脂糖凝胶的性质
 琼脂糖是从海藻中提取的一种直链多糖,它由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组成的线型多聚糖。当琼脂糖加热至90~100℃左右,即可形成清亮透明的液体。浇在模板上冷却至40~45℃时,凝固形成凝胶。琼脂糖带有亲水性,不含有带电荷的基团,不引起DNA变性,又不吸附被分离的物质,因此它是一种很好的凝胶剂。琼脂糖凝胶可区分相差100bp的DNA片段。
 2.DNA分子的迁移率
 DNA分子在电泳中的迁移率的因素是多方面的,除了决定于DNA分子大小与构型外,还有琼脂糖凝胶的浓度、电压大小、缓冲液pH值和电泳时的温度等。
 (二)实验操作中注意的问题
 1.加热溶解琼脂糖时应不断地摇动容器,使附于壁上的颗粒也完全溶解。
 2.溴化乙锭是一种强致癌剂,并有中度毒性,因此必须十分谨慎小心。操作时一定要戴手套,用过的手套要及时将手套顺手翻过来,让污染有溴化乙锭的面朝里。
 3.用254nm波长的紫外光进行观察的效果比366nm清晰,但产生的切口DNA量也较高。紫外光对眼睛有害,观察时应戴上眼镜或防护面罩。
 

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