琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术

琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 | 时间: December-11 14:42:30 | 分类:技术栏目

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[实验原理]

       琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应,DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭(ethidum bromide ,EB),在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带,在电场中,pH8.0条件下,凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。
    琼脂糖凝胶有如下特点:
   (1) DNA的分子大小 在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比,分子越大迁移得越慢。
 (2) 琼脂糖浓度     一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。
   (3) 电压     低电压时,线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加,不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,随着电压的增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。
   (4) 电泳温度   DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显,不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变,但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱,最好在4℃条件下电泳。
   (5) 嵌入染料 荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。
   (6) 离子强度 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶,电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化。
       对于天然的双链,常用的几种电泳缓冲液有TAE、TBE等,一般配制成浓缩母液,室温保存,用时稀释。
[实验仪器与设备]
     1. 恒温培养箱                   2. 琼脂糖凝胶电泳系统
     3. 高压灭菌锅                    4. 紫外线透射仪
[实验材料]
     1.三羟甲基氨基甲烷(Tris)      2.硼酸
     3.乙二胺四乙酸(EDTA)              4.溴酚蓝
     5.蔗糖                                         6.琼脂糖
     7.溴化乙锭                                  8.DNA marker
     9.DNA样品
[实验步骤]
1.缓冲液的配制
5×TBE(5倍体积的TBE贮存液)
   配1000ml 5×TBE:
Tris                      54g
硼酸                    27.5g
0.5mol/l EDTA    20ml
Ph8.0
凝胶加样缓冲液(6×)
溴酚蓝            0.25%
蔗糖                40%
③溴化乙锭溶液(EB)     0.5μg/ml
2.制备琼脂糖凝胶
 按照被分离DNA的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表:
          琼脂糖凝胶浓度           线性DNA的有效分离范围
                0.3%                         5-60   kb
                0.6%                         1-20   kb
                0.7%                         0.8-10 kb
                0.9%                         0.5-7 kb
                1.2%                         0.4-6 kb
                1.5%                         0.2-4 kb
                2.0%                         0.1-3 kb
 
3.胶板的制备
    (1) 用高压灭菌指示纸带将洗静、干燥的玻璃板的边缘(或电泳装置所皿备的塑料盘的开口)封住,形成一个胶膜(将胶膜放在工作台的水平位置上,用水平仪校正)。
    (2) 配制足够用于灌满电泳槽和制备凝胶所需的电泳缓冲液(1×TBE)。准确称量的琼脂糖粉。缓冲液不宜超过锥瓶或玻璃瓶的50%容量。 在电泳槽和凝胶中务必使用同一批次的电泳缓冲液,离子强度或pH值的微小差异会在凝胶中形成前沿,从而大大影响DNA片段的迁移率 。
    (3) 在锥瓶的瓶颈上松松地包上一层厚纸。如用玻璃瓶,瓶盖须拧松。在沸水浴或微波炉中将悬浮加热至琼脂糖溶解。注意:琼脂糖溶液若在微波炉里加热过长时间,溶液将过热并暴沸。应核对溶液的体积在煮沸过程中是否由于蒸发而减少,必要时用缓冲液补充。                                                                                    
    (4) 使溶液冷却至60℃。加入溴化乙锭(用水配制成10mg/ml的贮存液)到终浓度为0.5ug/ml,充分混匀。
    (5) 用移液器吸取少量琼脂糖溶液封固胶模边缘,凝固后,在距离底板0.5-10mm的位置上放置梳子,以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。如果梳子距玻璃板太近,则拔出梳子时孔底将有破裂的危险,破裂后会使样品从玻璃板之间渗透。
    (6)将剩余的温热琼脂糖溶液倒入胶模中。凝胶的厚度在3-5mm之间。检查一下梳子的齿下或齿间是否有气泡。
    (7)在凝胶完全凝固后(于室温放置30-45分钟) ,小心移去梳子和高压灭菌纸带,将凝胶放入电泳槽中。
    低熔点琼脂糖凝胶及浓度低于0.5%的琼脂糖凝胶应冷却至4℃,并在冷库中电泳。
 (8)加入恰好没过胶面约1mm深的足量电泳缓冲液。
4.加样
    DNA样品与所需加样缓冲液混合后,用微量移液器,慢慢将混合物加至样品槽中。此时凝胶已浸没在缓冲液中。 一个加样孔的最大加样量依据DNA的数量及大小而定,一般为20-30μl样品。
已知大小的DNA标准,应同时加在凝胶的左凝胶的左侧和右侧孔内。确定未知DNA的大小。测量未知DNA的大小时,要所有样品都用相同的样品缓冲液。
5.电泳
    在低电压条件下,线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系,但是,在电场增加时,不同相对分子质量的DNA片段泳动度的增加是有差别的。因此,随着电压的增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围随之减小。为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率,电场强度不应高于5V/cm。当溴酚蓝指示剂移到到距离胶板下沿约1-2cm处,停止电泳。
 

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