琼脂糖凝胶电泳DNA回收实验方法和注意事项

琼脂糖凝胶电泳DNA回收实验方法和注意事项 | 时间: May-15 17:00:14 | 分类:技术栏目

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实验前准备及重要注意事项

1.第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer PW中加入无水乙醇。
2.使用前请检查Buffer PG,如果出现结晶或者沉淀,可在37℃水浴中放置3-5分钟,即可恢复澄清。
3.电泳时最好使用新的电泳缓冲液,避免影响电泳和回收效果;如下一步实验要求较高,请尽量使用TAE电泳缓冲液。
4.切胶时,紫外照射时间应尽量短,以免对DNA造成损伤。
5.回收率与初始DNA量和洗脱体积有关,初始量越少,洗脱体积越少,回收率越低。
6.将水浴锅预热至50℃。
7.Buffer PG中含有pH指示剂,当pH≤7.5时溶液的颜色为黄色,此时DNA才能够有效的与膜结合,当pH值偏高时溶液的颜色变为桔红色和紫色,需要进行调整。
8.所有离心步骤均可室温下
操作步骤
 1.将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分),放入干净的离心管(自备)中,称量计算凝胶重量(提前记录离心管重量)。注意:若胶块的体积过大,可将胶块切成碎块。
 2.向胶块中加入1倍体积Buffer PG(如凝胶重为100 mg,其体积可视为100 μl,依此类推)。
 3.50℃水浴温育,其间每隔2-3分钟温和地上下颠倒离心管,待溶胶液为黄色,以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块,可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟直至胶块完全溶解。
注意:1)凝胶完全融解后胶溶液为黄色,可进行后续操作;若胶溶液为桔红色或紫色,可向胶溶液中加10-30 μl 的3 M醋酸钠(pH 5.0),将溶液的颜色调为黄色后再进行后续操作。
     2)胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱,吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱。
 4.(可选步骤)当回收片段<300 bp时,应加入1/2胶体积的异丙醇,上下颠倒 混匀(如凝胶重100 mg,则加入50 μl的异丙醇)。
 5.柱平衡:向已装入收集管中的吸附柱(Spin Columns DM)中加入200 μl Buffer PS,13,000 rpm(~16,200×g)离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
 6.将步骤3或4所得溶液加入到已装入收集管的吸附柱中,室温放置2分钟,13,000 rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。注意:吸附柱容积为750 μl,若样品体积大于750 μl 可分批加入。
 7.向吸附柱中加入450 μl Buffer PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),13,000 rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。注意:如果纯化的DNA用于盐敏感的实验(例如平末端连接或直接测序),建议加入Buffer PW
 静置2-5分钟再离心。
 8.重复步骤7。
 9.13,000 rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液。注意:这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除,乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。10.将吸附柱放到一个新的1.5 ml离心管(自备)中,向吸附膜中间位置悬空滴加50 μl
 Buffer EB,室温放置2分钟。13,000 rpm离心1分钟,收集DNA溶液。-20℃保.DNA。
注意:1)为了提高DNA的回收量,可将离心得到的溶液重新滴加到吸附柱中,室温放置2分钟,13,000 rpm离心1分钟。
 2)洗脱体积不应小于30 μl,体积过少会影响回收效率。
 3)回收大于10 kb的DNA片段时,Buffer EB应在50℃水浴中预热,可增加回收效率。
 备注:本试剂盒也适用于PCR产物的纯化回收。在PCR反应液中加入等体积的BufferPG,充分混匀(对于回收小于150bp的小片段可将溶液的体积增加到3倍以提高回收率)接上述步骤5进行后续操作。

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