蛋白电泳现像之涂抹痕迹

蛋白电泳现像之涂抹痕迹 | 时间: January-4 18:05:40 | 分类:技术栏目

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    如果你能够非常熟练的制备一块完美的凝胶,甚至对它进行改进都不十分困难,那么你真的应该值得庆幸。但是如果你不能达到这个水平也不要灰心。

    所有的优秀的科学家都是从失败中成长起来的,事实上,如果不出错我们就很难学到更多的东西。
 
    我们整理了 SDS-PAGE「失误大全」,包括了过去实验室中许多学生跑的最「烂」的胶,它们代表了人们在跑胶是最容易犯的多种错误(当然这些错误仍在更新之中)。
 
    看你自己的胶缺陷也许并不能很好的解决问题,至少不是最完美的解决方式,本文用图例指出你可能在哪一些方面改进你的技术。
 
    涂抹痕迹可能由于多种原因引起,但是最常见的原因是聚丙烯酰胺凝胶倒胶的不均匀或者上样量过大。
 电泳凝胶
    这块胶倒胶不正确,在上部胶倒入制胶槽之前就已经发生聚合。首先倒入的胶聚合发生的太快了。与其重新倒胶,不如停止倒胶重新准备新的聚丙烯酰胺混合液,然后将新的胶倒入旧胶的上方。但是显然这种连接不是非常牢固。我推荐重新倒胶,制胶很关键,如果你后续还要做 blot,胶没有跑好浪费太多。
 电泳凝胶
    这块胶每孔上样量过大。大多数的泳道还是能分清条带,但是在 3、4 道涂抹痕迹非常明显。这些泳道的样品主要含有一种蛋白(血红蛋白的亚基),与 9、10 道一样。但是,3、4 道的样品低估了红细胞裂解物和红细胞胞浆组分中的蛋白含量。这些组分包含了过多的蛋白以至于样品需要稀释后才能进行蛋白含量测定。但是这名学生却忘记了这个样品已经稀释过了,因此造成了蛋白浓度的低估。(严重的失误)
 
    小型胶每孔的蛋白样品的量为 20-40 微克,取决于所需的分辨率和混合液中包含的多肽数目。但是,如果是一个纯化样品上样,一个带包含了 20-40 微克蛋白,那么其结果肯定也是一团糟。
 电泳凝胶
    这也是一个上样量过大的例子,这名学生似乎犯了和例 2 中同样的错误,因此在胶上也表现出各泳道的不一致性。
 
    涂抹痕迹可能常见于用非连续胶跑膜相关蛋白这类脂质含量丰富的样品。在非连续 PAGE 中,样品蛋白基于两个因素而被超浓缩。
 
    首先,当样品从非限制性的积层胶移动至限制速度的分离胶时迁移速率陡然下降。其次,也是最重要的,pH 变化造成蛋白样品电泳速率的改变,导致样品突然停滞。一个高约半厘米左右的样品被压缩成为一个仅为数微米厚的薄层条带,局部蛋白浓度急剧增加。
 
    胞膜相关蛋白一般于较低浓度是沉淀,因此泳道的顶部通常有一条深色的条带含有沉淀的蛋白。当电泳进行时沉淀的蛋白重新溶解然后持续进入凝胶,因此造成了一个持续性的较深的不可分辨的背景。许多膜相关蛋白的凝胶图像都显示同样的特征。
 电泳凝胶
    上图中 4、7 道的蛋白样品虽然含有相同的蛋白量,但是第 4 道的样品中含有的膜蛋白的量超过了凝胶的分辨能力,造成了很深的涂抹痕迹。

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