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PCR实验常见问答

PCR实验常见问答 | 时间: December-4 18:34:53 | 分类:技术栏目

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   常见问答

  Q-1:
  LA PCR的反应条件?
  A-1:
  因扩增片段的大小、反应体积、使用扩增仪器的不同而不同。
  ◇ 循环次数
  根据模板DNA的量以及扩增片段的大小,设定25 ~ 30个循环。
  如果循环次数太少,扩增量不足;如果循环次数太多,则会出现Smear。
  ◇ Anneal以及Extension
  合适的Anneal温度通常在45 ~ 68之间 (预备实验可2℃间隔进行)。另外,由于TaKaRa LA Taq 在60 ~ 68间也有很高的活性, 因此可在此温度范围内设定Anneal-Extension温度, 进行2 Step PCR。Anneal-Extension温度为68℃ 时,每kbp大体可设定30秒 ~ 1分钟;当温度设定在68℃以下时, 时间设定可稍长一些。通常,Anneal温度太高,有时会得不到扩增产物;Anneal温度太低时,容易发生非特异性反应。另外,Extension时间太短时,会得不到扩增产物或者会有一些短的非特异性产物优先生成;而Extension时间太长时,会出现Smear。
  Q-2:
  选择LA PCR引物 (Primer) 时的注意事项?
  A-2:
  特异性非常重要。20mer左右的Primer, 如果特异性高,扩增20 kbp没有问题,但如果可能的话,建议设计30 ~ 35mer左右。使用特异性低的Primer时,会出现很多非特异性产物。
  Q-3:
  LA PCR时酶的使用量?
  A-3:
  50 μl的反应体系可使用2.5 U的TaKaRa LA Taq。但合适的用量也与模板DNA的量及Complexity、扩增片段大小有关。酶量过多时,易发生非特异性反应,出现Smear;而酶量过少时,反应性能下降。
  Q-4:
  LA PCR时模板DNA的调制方法?
  A-4:
  模板DNA的质量是LA PCR成功与否的重要因素。扩增超过10 kbp的DNA片段时,用简单的方法 (例如Cell只经过加热处理或Protease处理) 调制的DNA作模板不太合适, 建议使用充分精制的完整的DNA (没有Nick等)。
  Q-5:
  是否可以对λ 噬菌体直接进行LA PCR反应?
  A-5:
  可以。99℃、10 min处理后的噬菌体约106 ~ 107 pfu作为模板,至少可扩增8 kbp的DNA片段。
  Q-6:
  对Mammalian cell或E. coli 只进行热处理 (98, 2 min) 或Protease处理的样品可否进行LA PCR?
  A-6:
  ◇ 对E. coli只进行热处理可扩增10 kbp的DNA片段 (50 ml PCR反应液中37℃ Overnight culture in L-both 使用2 μl)。
  ◇ Human细胞 (培养细胞) 如只经过热处理,可扩增数百bp;经过Protease处理、 热处理后的样品,最多可扩增1 ~ 2 kbp。所以,如果要扩增长链DNA,建议使用经过充分精制的完整的DNA作模板。
  Q-7:
  使用LA Taq是否也产生A的Overhang? (PCR产物是否可直接克隆于T-vector中?)
  A-7:
  可以。使用TaKaRa LA Taq 及TaKaRa Ex Taq 时的PCR产物产生A的Overhang,与使用TaKaRa Taq 时的PCR产物克隆于T-vector 的效率基本相同。
 

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