PCR实验常见问答

PCR实验常见问答 | 时间: December-4 18:34:53 | 分类:技术栏目

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   常见问答

  Q-1:

  LA PCR的反应条件?

  A-1:

  因扩增片段的大小、反应体积、使用扩增仪器的不同而不同。

   循环次数

  根据模板DNA的量以及扩增片段的大小,设定25 ~ 30个循环。

  如果循环次数太少,扩增量不足;如果循环次数太多,则会出现Smear

   Anneal以及Extension

  合适的Anneal温度通常在45 ~ 68之间 (预备实验可2间隔进行)。另外,由于TaKaRa LA Taq 60 ~ 68间也有很高的活性, 因此可在此温度范围内设定Anneal-Extension温度, 进行2 Step PCRAnneal-Extension温度为68 时,每kbp大体可设定30 ~ 1分钟;当温度设定在68以下时, 时间设定可稍长一些。通常,Anneal温度太高,有时会得不到扩增产物;Anneal温度太低时,容易发生非特异性反应。另外,Extension时间太短时,会得不到扩增产物或者会有一些短的非特异性产物优先生成;Extension时间太长时,会出现Smear

  Q-2:

  选择LA PCR引物 (Primer) 时的注意事项?

  A-2:

  特异性非常重要。20mer左右的Primer, 如果特异性高,扩增20 kbp没有问题,但如果可能的话,建议设计30 ~ 35mer左右。使用特异性低的Primer时,会出现很多非特异性产物。

  Q-3:

  LA PCR时酶的使用量?

  A-3:

  50 μl的反应体系可使用2.5 UTaKaRa LA Taq。但合适的用量也与模板DNA的量及Complexity、扩增片段大小有关。酶量过多时,易发生非特异性反应,出现Smear;而酶量过少时,反应性能下降。

  Q-4:

  LA PCR时模板DNA的调制方法?

  A-4:

  模板DNA的质量是LA PCR成功与否的重要因素。扩增超过10 kbpDNA片段时,用简单的方法 (例如Cell只经过加热处理或Protease处理) 调制的DNA作模板不太合适, 建议使用充分精制的完整的DNA (没有Nick)

  Q-5:

  是否可以对λ 噬菌体直接进行LA PCR反应?

  A-5:

  可以。9910 min处理后的噬菌体约106 ~ 107 pfu作为模板,至少可扩增8 kbpDNA片段。

  Q-6:

  对Mammalian cellE. coli 只进行热处理 (98 2 min) Protease处理的样品可否进行LA PCR?

  A-6:

   E. coli只进行热处理可扩增10 kbpDNA片段 (50 ml PCR反应液中37 Overnight culture in L-both 使用2 μl)

   Human细胞 (培养细胞) 如只经过热处理,可扩增数百bp;经过Protease处理、 热处理后的样品,较多可扩增1 ~ 2 kbp。所以,如果要扩增长链DNA,建议使用经过充分精制的完整的DNA作模板。

  Q-7:

  使用LA Taq是否也产生AOverhang? (PCR产物是否可直接克隆于T-vector?)

  A-7:

  可以。使用TaKaRa LA Taq TaKaRa Ex Taq 时的PCR产物产生AOverhang,与使用TaKaRa Taq 时的PCR产物克隆于T-vector 的效率基本相同。

 

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